在微生物實驗室, 必須達到一定程度的無菌狀態(tài), 免于微生物污染. 假如在一個骯臟的實驗室或者早先打翻過樣品的地方做微生物實驗, 引入新的微生物污染樣品的幾率是很大的。微生物的實驗可以分為兩大部分: 準備培養(yǎng)基和樣品檢驗。事實上, 保持整個實驗室清潔是非常重要的, 這樣就不用在滅菌前擔(dān)心太多了, 然而, 滅菌后必須保證樣品或者培養(yǎng)基免受污染。其實, 可以把滅菌想像成"一扇門", 在培養(yǎng)基中或者一些設(shè)備比如吸管的微生物都在滅菌過程中被殺死了, 沒有微生物困擾實驗了。必須保證滅菌后的環(huán)境(門后的部分)的潔凈, 杜絕滅菌后的培養(yǎng)基和設(shè)備受到污染。無菌的重要性無菌技術(shù) – 高壓濕熱滅菌要點 描述 原理 在壓力下產(chǎn)生的濕熱的蒸汽殺死微生物的營養(yǎng)體和孢子. 密封 滅菌鍋必須密閉以阻隔外部空氣, 避免空氣的存在會影響壓力并降低滅菌鍋里面的溫度 滅菌壓力 在滅菌國內(nèi), 合適的滅菌溫度是通過壓力達到的, 壓力對于滅菌沒有效用但是使蒸汽溫度上升. 對于標準操作來說, 15lbs/inch2時的1210C并趕走所有空氣可以達到滅菌的效果 滅菌時間 當?shù)竭_一定的溫度和壓力時, 需要保持一定的時間來達到效果, 為了殺滅微生物, 1210C必須保持至少15分鐘。 培養(yǎng)基的滅菌 大部分情況下, 實驗室配置培養(yǎng)基后應(yīng)滅菌, 滅菌時應(yīng)根據(jù)供應(yīng)商指導(dǎo), 使用合適的溫度時間; 有些培養(yǎng)基不適合滅菌的. 器皿的滅菌 當滅菌那些器皿時, 需要考慮使用數(shù)量, 比如, 一天用10根吸管, 在滅菌時, 一般就可以以10根為一包, 這樣可以減低器皿在使用過程中遭受微生物的污染的可能性. 滅菌條 在滅菌過程中, 可以用滅菌條來監(jiān)控效果, 滅菌條在滅菌前是有顏色的, 滅菌后會變成黑色. 重新滅菌 假如一次滅菌無效, 可以重新進行滅菌過程, 但是, 培養(yǎng)基是不可以進行第二次滅菌的, 應(yīng)拋棄. 儲存 滅菌完成后, 培養(yǎng)基和器皿應(yīng)妥善儲存. 一般來說, 培養(yǎng)基應(yīng)存放于避光的潔凈空間, 同時應(yīng)參照供應(yīng)商的指示. 無菌技術(shù) – 過濾 (Filtration)要點 描述 簡述 物理分離方法, 使用過濾將微生物從液體培養(yǎng)基分離使用于對熱敏感的培養(yǎng)基和化學(xué)品, 比如, 當需要酒石酸來調(diào)節(jié)OSA的酸度時由于不需要加熱和冷卻過程, 過濾比高溫濕熱滅菌省時間, 過濾頭 0.2微米的過濾頭可以分離所有的細菌營養(yǎng)體, 把它安裝在針筒末端. 無菌過程注意點要點 描述 綜述 一旦培養(yǎng)基或者器皿經(jīng)過滅菌過程, 這種滅菌狀態(tài)應(yīng)保持直到實驗結(jié)束. 區(qū)域 能把培養(yǎng)基準備區(qū)域(門外)和實驗區(qū)域(門內(nèi))分開. 工作臺面 工作前必須消毒, 可以用70%的酒精, 也可以用含氯的消毒劑. 消毒時間 不管使用何種消毒劑, 需要提供充分的消毒時間來殺滅微生物, 一般5-10分鐘. 可以用紙巾擦干表面 潔凈臺 必須有2個光源: 普通照明用和殺菌紫外光. 紫外燈用于保持工作臺面免于微生物污染. 在使用前仍然需要使用消毒劑清潔. 擺放 應(yīng)該有好習(xí)慣把工作桌面的物品擺放好, 把移動放到zui低限度, 避免帶來污染 鑷子 如果使用薄膜過濾法, 需要準備一個小燒杯并有少量酒精, 鑷子不用時就放在杯子里 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基使用前, 應(yīng)該有相關(guān)日期, 比如配置日期, 或者實驗室收到日期(直接使用的培養(yǎng)基). 假如沒有所需日期, 這個培養(yǎng)基不能使用. 實驗服 穿著干凈的實驗服, 袖子應(yīng)卷起至肘部以避免碰到培養(yǎng)基或樣品帶來污染, 當然, 做實驗前要洗手. 實驗的無菌技術(shù)注意點采樣 個人衛(wèi)生 酒精燈 樣品應(yīng)無菌采得使用無菌采樣袋或者采樣瓶采樣員應(yīng)戴防護手套, 在采樣前燒采樣口樣品容器應(yīng)緊閉并安全儲存. 萬一培養(yǎng)基或者樣品濺到實驗服上, 應(yīng)在做完一個實驗后換上干凈的咳嗽或者鼻塞可能會帶來微生物并影響實驗, 應(yīng)戴好防護手套面罩. 使用本森燈或者酒精燈, 在實驗前點燃火焰在實驗區(qū)域產(chǎn)生一個防護層, 可以防止那些懸浮在空氣中的微生物掉落在工作臺面上或者培養(yǎng)基上. 開瓶 瓶口 培養(yǎng)皿 開瓶前, 應(yīng)用清潔劑的紙巾清潔瓶蓋和附近區(qū)域, 除去蓋子上可能留存的微生物 蓋子打開后, 玻璃瓶口應(yīng)進行滅菌, 可以在酒精燈上方旋轉(zhuǎn)瓶口和螺紋, 一般2-3秒. 當打開培養(yǎng)皿時, 不能*移除蓋子, 而應(yīng)該保持在培養(yǎng)皿的上側(cè), 從而能夠倒入培養(yǎng)基或者樣品, 這樣可以減少空氣灰塵或者微生物的污染;倒完培養(yǎng)基或者樣品后, 瓶口重新過火, 蓋蓋子, 用消毒劑清潔. 濾膜 鑷子 打開薄膜包裝, 不能碰到薄膜! 用鑷子把薄膜移除包裝并放到過濾頭上, 過濾的漏斗不能*移開, 只需移開一點點放入濾膜即可過濾完后, 用鑷子把濾膜轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿中, 放置于中間 用鑷子轉(zhuǎn)移濾膜過火時, 拿住鑷子的尾部, 放到火焰上, 保持一下能夠到火就好, 時間太長會在尖部結(jié)碳 拿鑷子的時候, 尾部向上直至燒完. 實驗結(jié)束 打掃 廢棄物 實驗結(jié)束后, 培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱; 剩余的培養(yǎng)基可以放回儲存區(qū)域, 蓋子必須蓋緊 拋棄廢棄物, 比如樣品袋; 可回用的物品放在遠離工作區(qū)域的地方以回收, 清洗, 滅菌.用含有消毒劑的紙巾清潔工作臺面. 在實驗過程中暴露于微生物的物品應(yīng)作為有害廢棄物這些廢棄物可能含有微生物并致病; 假如含有致病菌可能會產(chǎn)生公共衛(wèi)生的事件.廢棄物能夠進行濕熱滅菌 從微生物的實驗室布局角度一個設(shè)計合理的實驗室能提供一個合格的環(huán)境以支持實驗?zāi)軌虬踩行У剡M行. 首先, 需要為實驗室選擇一個合適的物理位置:遠離其他操作區(qū)域, 比如, 生產(chǎn)或者儲運；沒有從其他區(qū)域進入實驗室的直接入口；實驗室必須是微生物實驗；實驗室應(yīng)分為準備區(qū)域和測試區(qū)域. 濕熱滅菌鍋, 作為這兩個區(qū)域的典型的分隔(門). 這種分隔保證了能有效使用無菌技術(shù)并幫助防止培養(yǎng)基和樣品的交叉污染；假如兩個區(qū)域無法分開, 實驗室應(yīng)根據(jù)實驗準備和測試兩個行為來區(qū)分不同的區(qū)域。通風(fēng)和氣流 安保 工作區(qū)域 微生物實驗室應(yīng)該有單獨的通風(fēng)系統(tǒng), 與其他操作區(qū)域的空氣供給分開;房間應(yīng)該是負壓的, 這表示實驗室里面的空氣永遠是向內(nèi)流動的;空調(diào)系統(tǒng)的排氣必須直接排出實驗室, 空調(diào)系統(tǒng)應(yīng)定時清洗, 并關(guān)注空氣過濾器的清潔 實驗室應(yīng)該是限制進入的, 可以是卡片控制或者其他方式, 只有那些被允許進入實驗室的人員才能進入 實驗室人員應(yīng)該有充足的工作區(qū)域, 從GLP標準來說, 每人應(yīng)有20平方米的區(qū)域. 充足的工作區(qū)域可以避免工作中人員的碰撞, 也避免了交叉污染. 易清潔 門和窗 照明 實驗室的墻面, 屋頂和門都應(yīng)該是平滑的, 光潔易于清洗消毒的;墻的接縫包括強和墻之間, 強和地面之間應(yīng)該是弧形的任何地方都應(yīng)該不能聚集灰塵, 例如窗臺或者窗簾柜子應(yīng)該是可移動的或者是不著地的以方便清掃. 窗戶應(yīng)密封, 門應(yīng)緊閉以避免外面空氣進入實驗室如果窗戶壞了或者有裂縫額, 應(yīng)及時報修, 并盡快修好 實驗室應(yīng)有充足的照明, 包括不間斷電源或者備用發(fā)電機 遵照GLP相關(guān)的安全規(guī)則 1.GLP要點 – 工作區(qū)域要點 描述 總體安排 實驗前應(yīng)做好儀器, 試劑和培養(yǎng)基的所有準備工作, 這樣可以合理利用時間并得到穩(wěn)定的實驗結(jié)果 桌面安放 多余的培養(yǎng)皿, 燒瓶或者濾紙可能會干擾實驗并帶來潛在的濺出, 打碎或者交叉污染. 實驗前消毒 在配制培養(yǎng)基或者開始試驗前, 應(yīng)該清潔并消毒工作桌面. *的消毒劑是70%的酒精溶液, 含氯水的溶液, 或者公司批準的其他消毒劑. 使用一次性的消毒紙巾, 不能使用毛巾或者海綿. 清潔后, 應(yīng)等待幾分鐘以使有充分的時間殺滅微生物, 可以用紙巾擦干. 試驗后消毒 實驗結(jié)束后, *清潔工作區(qū)域, 仍然使用70%酒精溶液或者公司批準的其他消毒劑, 保持一段時間, 然后擦干 有害廢棄物的處置 必須有效管理微生物的有毒廢棄物, 任何和微生物培養(yǎng)或者培養(yǎng)基相關(guān)的物品都應(yīng)被看作有害物質(zhì); 因為他們可能含有致病菌, 需要小心處理 廢棄物的滅菌 濕熱滅菌是zui簡單也是zui有效的處理污染物質(zhì)和有害物質(zhì)的方法. 用過的培養(yǎng)皿應(yīng)放在滅菌袋中. 滅菌后, 可以當作一般廢棄物處理 重復(fù)使用器皿的滅菌 當需要對小件物品(比如移液管)滅菌時, 可以根據(jù)實際用量分組包裝. 濕熱滅菌后, 袋包裝冷卻并保存. 避免浪費 合理安排是非常重要的; 實驗室工作需要, 但是有時候我們也需要快速工作, 因為花非常多時間會延長設(shè)備, 培養(yǎng)基, 或者樣品暴露在環(huán)境中的時間. 把需要用的物品放在手邊可以用的地方可以節(jié)約時間并提高工作的有效性. 2.GLP要點 – 潔凈工作臺簡介 使用 監(jiān)控 潔凈工作臺提供了控制來自環(huán)境的污染并提供工作區(qū)域的潔凈空氣. 潔凈空氣吹向工作區(qū)域, 同時, 可以避免外部空氣進入工作區(qū)域 使用時, 紫外光線(或者紫外燈)應(yīng)關(guān)閉, 但是使用后應(yīng)打開. 如果紫外燈沒有打開工作臺沒有開啟, 工作臺不能開始使用; 必須清潔工作臺, 開啟電源并打開紫外燈, 保持30分鐘. 潔凈工作臺需要進行日常的確認, 一般有第三方公司進行. 一個有效的實驗室應(yīng)該是一個安全的實驗室. 假如疏忽安全的話, 許多每天使用的培養(yǎng)基或者設(shè)備會產(chǎn)生危害. 減少這些危害帶來的風(fēng)險不僅僅保護了工作場所, 更重要的是, 保護了自身免于危險。利用常識并遵照GLP相關(guān)的安全規(guī)則, 我們就能把由于微生物相關(guān)的行為帶來的潛在危害降低到zui小。安全用品 移動 安全用品包含口罩, 手套和眼部防護. 口罩防止培養(yǎng)基和樣品受到污染, 可能來自于咳嗽或者鼻涕; 根據(jù)當?shù)氐囊蠛土?xí)慣, 每個實驗室會有不同的要求戴手套是為了防止培養(yǎng)基或者其他刺激性物質(zhì)接觸皮膚; 在從濕熱滅菌鍋內(nèi)取出容器或則器皿時, 需要戴防熱手套在配置培養(yǎng)基和實驗中佩戴防護眼鏡是一個很好的習(xí)慣, 能夠購買帶有屈光度的防護眼鏡為佳. 當移動培養(yǎng)基或者樣品時, 應(yīng)小心注意以避免濺出或者潑出; 突然的移動會產(chǎn)生安全危害或者導(dǎo)致實驗無效不要使用夸張的動作或者行為同時, 不要把任何東西, 比如吸管, 放到嘴里 明火 濕熱滅菌鍋 實驗中需要用到酒精燈或其他明火, 但是假如使用不當會帶來比較高的安全危險確保酒精燈不用時*關(guān)閉, 當有閥門時經(jīng)常檢查墊圈是否有裂痕或者泄露.操作酒精燈時, 應(yīng)確保火焰不會接觸衣物或者皮膚. 可燃物品, 比如記錄本, 應(yīng)遠離火焰以避免意外點燃. 同時, 要注意可燃液體的容器. 每次使用后應(yīng)蓋好蓋子并遠離酒精燈火焰使用火焰進行滅菌工作時, 可使用鑷子. 把鑷子放在含有95%酒精的燒杯中, 使用時, 把鑷子在火焰上灼燒1-2秒, 移開鑷子并等待火焰熄滅. 拿著鑷子是應(yīng)向下, 使熱的酒精不會流到手上. 濕熱滅菌鍋使用高壓下產(chǎn)生的蒸汽, 溫度可達1210C, 殺死了微生物, 同樣可以帶來人類組織的灼傷, 所以必須特別小心地操作; 如此高的溫度以及蒸汽能帶來極大的潛在傷害, 即使是殘留的蒸汽也能帶來很大的危險. 打開滅菌鍋時需要特別小心, 站在邊上避免面對熱量和蒸汽, 緩慢的打開門, 同時, 戴好防熱手套. 把需要滅菌的培養(yǎng)基和器皿平均放置在托盤上, 大的物品放在邊上, 確保物品不會相互碰撞. 這樣可以是熱量均勻擴散并平衡整個托盤 潔凈臺 樣品操作 在潔凈臺工作時必須關(guān)閉紫外燈. 紫外光線是危險的,不要把手或者手指放在紫外燈下, 以免灼傷皮膚; 不要直接看紫外光線以免損傷眼睛 培養(yǎng)基和樣品: 用火焰灼燒瓶口時, 停留4-5秒, 旋轉(zhuǎn)使整個表面都能被灼燒, 不要停留太久, 不要濺出樣品或者培養(yǎng)基假如樣品是瓶裝的, 不要直接灼燒以免爆開. 可以取2個燒杯, 倒入70%酒精, 把瓶子倒置放入一個燒杯中, 使蓋子和瓶頸的2.5厘米處能浸沒在酒精中, 拿出瓶子用干凈的布擦干; 同理, 放入第二個燒杯, 拿出瓶子直立待酒精自然蒸發(fā). 開瓶時應(yīng)特別小心不能污染樣品, 可以用消毒紙巾開旋蓋的瓶子; 用浸沒在95%酒精并灼燒的開瓶器打開壓蓋瓶. 打開瓶子后, 使用相同的方法灼燒瓶口, 并確保用于消毒的酒精*揮發(fā).拉罐可以使用相同的程序或者用含70%酒精的棉球擦拭頂部, 假如罐子必須用開罐器, 這個開罐器操作同開瓶器. 無菌包裝的產(chǎn)品用含70%酒精的棉球擦拭 細菌和霉菌培養(yǎng)箱必須分開放置嗎？在CNAS-CL09:2013《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明 》有此規(guī)定：5.3.3 e)檢測樣品中的霉菌時，要有適當?shù)拇胧┛刂奇咦釉诳諝庵械臄U散。但未見到明確規(guī)定細菌培養(yǎng)箱和霉菌培養(yǎng)箱不能在同一房間的規(guī)定。一般實驗室都有三種培養(yǎng)箱，結(jié)構(gòu)設(shè)計上分為兩種，一種是內(nèi)部循環(huán)風(fēng)溫度平衡的，第二種是內(nèi)外熱空氣流動自動平衡型的，另外第三種是熱輻射溫度平衡型的。有網(wǎng)友認為，*種和第三種應(yīng)該可以放在一個實驗室，保持一定距離即可。第二種培養(yǎng)箱應(yīng)該不能放在一個實驗室。據(jù)說，CNAS現(xiàn)場評審，會提出細菌和霉菌培養(yǎng)箱分開放置要求。 防止培養(yǎng)基長霉的方法當環(huán)境溫度不適應(yīng)果蠅生長時(溫度低于18℃) ,培養(yǎng)基接種后的7d內(nèi),特別容易長霉。要避免長霉,應(yīng)注意:①培養(yǎng)果蠅的器皿要嚴格消毒。培養(yǎng)瓶洗干凈后,自然涼干, 再與棉塞一道進行高溫干燥滅菌(120℃, 30min) 。②培養(yǎng)基營養(yǎng)要全面。果蠅培養(yǎng)基的種類很多,本實驗室用的是玉米培養(yǎng)基,配方如下:水750mL煮開,加瓊脂6. 2g,待瓊脂溶解后加白糖62.5g,攪拌溶解后加調(diào)成糊狀的玉米糊(玉米粉82. 5g,用冷水調(diào)成糊狀) ,煮開2～3min,加酵母粉7g,加熱1～2min,攪拌均勻后,移去火源,加丙酸2mL (起殺菌防霉的作用) 。培養(yǎng)基稍稍冷卻后,倒入已滅菌的培養(yǎng)基瓶中,盡量不要讓培養(yǎng)基粘在瓶壁上,塞好棉塞,放入仍有余熱的干燥箱中將瓶壁上的水蒸干。③接種時消好毒。在無菌室內(nèi)接種, 如沒有無菌室, 在接種前用75%酒精棉球擦雙手一遍。接種后,放入適宜果蠅生長溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)果蠅(溫度20～25℃) ,一旦下一代成蠅孵出來后,培養(yǎng)基就不易長霉。 一般微生物實驗室只有一個培養(yǎng)室，而用于微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)箱一般是內(nèi)循環(huán)的。所以是可以同一個房間的。